Гистологическое исследование - это исследование тканей под микроскопом. А цитологическое исследование отличается от гистологического тем, что при нём проводится не исследование ткани, а исследование клеток.
Методы световой микроскопии
Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.
Метод светлого поля и его разновидности
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д.
Метод темного поля и его разновидности
Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры не окрашенного материала. При этом лучи от осветителя падают на препарат под косым углом, и объект исследования проявляется освещенным в темном поле..
Метод фазового контраста
При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные — фаза световой волны, что и используют для получения высоко контрастного изображения.
Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия позволяет изучать ультраструктурную организацию тканевых компонентов на основе анализа анизотропии и/или двойного лучепреломления
Метод интерференционного контраста
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором
Метод исследования в свете люминесценции
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами.
Ультрафиолетовая микроскопия . Основана на применении ультрафиолетовых лучей с длиной волны менее 380 нм, что позволяет увеличить разрешающую способность объективов с 0,2…0,3 мкм до 0,11 мкм. Требует применения специальных ультрафиолетовых микроскопов, в которых используются ультрафиолетовые осветители, кварцевая оптика и преобразователи ультрафиолетовых лучей в видимую часть спектра. Многие вещества, входящие в состав клеток (например, нуклеиновые кислоты), избирательно поглощают ультрафиолетовые лучи, что используется для определения количества этих веществ в клетке.
Трансмиссионная микроскопия . В трансмиссионных микроскопах электроны проходят через образец. Энергия электронов сравнительно невелика (до 50 кВ); при этом происходит их рассеивание и поглощение. Для создания контрастного изображения применяются особые методы подготовки материала.
Сканирующие электронные микроскопы основаны на сканировании образца. При этом точно сфокусированный пучок электронов пробегает по поверхности образца, а отраженные электроны формируют изображение, подобное трехмерному. Разрешающая способность сканирующего микроскопа меньше, чем у трансмиссионного (5…20 нм).
Высоковольтные электронные микроскопы основаны на использовании электронов сверхвысоких энергий (до 1 МВ – одного миллиона вольт). Столь мощные пучки пробивают относительно толстые срезы (до 5 мкм), что позволяет использовать этот тип микроскопии для изучения целостных клеток.
Клетки замораживают при температуре жидкого азота (196 О С) в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ. Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов.
Метод культуры клеток и тканей
заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели.
Микрургия (micrurgia; микр + ergon - работа, действие) - совокупность методических приемов и технических средств для осуществления операций на очень мелких объектах: одноклеточных организмах, отдельных клетках многоклеточных, внутриклеточных структурах.
Гетерокарион — соматическая клетка, образованная в результате слияния родительских клеток с гаплоидными генетически различными ядрами. Образовавшиеся гетерокарионы дают начало двум одноядерным гибридным клеткам.
В 1965 году английский ученый Г. Харрис впервые получил гетерокарионы, образованные клетками мыши и человека.
Гибридизация- процесс образования или получения гибридов , в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной клетке
Оглавление темы "Методы выделения бактерий. Микроскопия. Питательные среды для культивирования бактерий.":Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.
Рис. 11-4. Схема люминесцентного микроскопа .Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой - мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.
Рис. 11-5. Прямая иммунофлюоресценция
. Прямой метод предполагает использование помеченных флюоресцирующим красителем AT к интересующему Аг; AT взаимодействуют с Аг в местах их локализации, что и позволяет визуализировать метка.
Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 11-4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминес-цирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра.
Рис. 11-6. Непрямая иммунофлюоресценция
. Непрямой метод предполагает использование двух различных AT. Первые AT реагируют с Аг микроорганизма, вторые AT (связанные с меткой) специфически взаимодействуют с первыми AT, являющимися Аг ко вторым AT. Метод значительно чувствительнее, чем прямая иммунофлюоресценция, так как с каждой молекулой первых AT связывается несколько молекул вторых AT.
Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT или лектинов, помеченных флюоро-хромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг изучаемого объекта. Варианты иммунофлюоресцентных реакций представлены на рис. 11-5 и 11-6.
Поляризационная микроскопия — один из высокоэффективных методов морфологического исследования, обладающий широкими возможностями идентификации биологических структур, что в сочетании с доступностью и относительной простотой обусловливает его высокую ценность. Метод позволяет изучать не только гистологическое строение препарата, но и некоторые его гистохимические параметры. В 40 —50-х годах XX в. поляризационную микроскопию причисляли к ультраструктурным методам, так как она позволяла видеть ультраструктурные способности тканей.
Поляризационная микроскопия предназначена для изучения свойств гистологических структур, обладающих способностью двоякого лучепреломления (анизотропии) — раздвоения светового луча при прохождении его через анизотропную среду. Световая волна в анизотропной среде распадается на две волны с взаимно перпендикулярными плоскостями колебаний электромагнитных волн. Эти плоскости называются плоскостями поляризации. Поляризованный свет отличается от обычного (неполяризованного) тем, что в последнем колебания световых волн происходят в различных плоскостях, а в поляризованном свете — лишь в определенной плоскости.
Для создания эффекта поляризации в поляризационном микроскопе применяются два поляроида. Первый, который называется поляризатором, помещается между осветителем микроскопа и гистологическим препаратом.Второй поляроид, находящийся между гистологическим препаратом и глазом исследователя, — анализатором. И поляризатор, и анализатор в оптическом отношении представляют собой совершенно одинаковые поляризационные фильтры, поэтому их можно менять местами (если конструкция микроскопа это позволяет). Ранее для поляризационной микроскопии применяли изготавливаемые из исландского шпата призмы Николя, Аренса или Томсона. У этих призм был ограничен угол преломления света. В настоящее время вместо них используют плоские поляризационные фильтры, продуцирующие широкопольный поляризованный свет.
В создании поляризованного света определяющую роль играет взаимное расположение поляризатора и анализатора относительно оптической оси микроскопа. Если они ориентированы таким образом, что тот и другой пропускают поляризованный свет в одной и той же плоскости, т.е. при совпадении их плоскостей поляризации, оба поляризационных фильтра способны пропускать поляризованный свет; поле зрения микроскопа при этом светлое (рис. 1,а).
Рис. 1 Препарат легкого человека в светлом поле, OlympusCX41 , объектив 10х
Если же плоскости поляризации поляризационных фильтров взаимно перпендикулярны (этого достигают путем поворота анализатора на 90° вокруг оптической оси микроскопа), то поляризованный свет не проходит и исследователь видит темное поле зрения (рис. 2).
При повороте поляризатора на 360° в процессе его вращения поле зрения дважды полностью затемнено и дважды полностью просветлено. В прошлом применяли компенсаторные фильтры Бернауэра, при использовании которых затемненное поле зрения имеет красноватый оттенок (U-TP530 ). При применении черных зеркальных фильтров затемненное поле зрения выглядит не полностью темным, а слабо подсвеченным.
Рис.2 Препарат легкого человека в поляризованном свете, объектив 10х
В тех случаях, когда при скрещенном положении поляризационных фильтров (т.е. в ортоскопии) на пути поляризованного света встречаются анизотропные субстанции, содержащиеся в гистологическом препарате, эти субстанции расщепляют поляризованный свет на два луча с взаимно перпендикулярными плоскостями колебаний световых волн. Световые лучи с плоскостью колебаний, совпадающей с плоскостью поляризации, проходят через анализатор, а с перпендикулярной — отсекаются, вследствие чего интенсивность светового потока, попадающего в глаз исследователя и на камеру, составляет лишь половину интенсивности исходного светового пучка. В результате описанных процессов анизотропные субстанции, находящиеся между двумя скрещенными поляризаторами, видны на темном фоне в виде светлых светящихся объектов. При этом изотропные структуры, не обладающие способностью двоякого лучепреломления, остаются темными.
Это также влияет на выбор камеры для поляризационной микроскопии . Так как задача стоит снять небольшие светлые сигналы на темном фоне, то обычно камеры для светлопольной микроскопии может быть недостаточно, из-за низкой чувствительности камеры и большого количества шумов, которые образуются при съемке. Для съемки в поляризационной микроскопии необходима камера для микроскопии с высокой чувствительностью и точной цветопередачей . Предпочтительно использовать камеры на базе CCD- матриц ( , VZ-CC50S), однако на текущем этапе можно применять и бюджетные варианты камер на базе CMOS-матриц Sonyсерии IMX ().
В биологических тканях имеется достаточное количество анизотропных структур: элементы сократительного аппарата мышц, амилоид, мочевая кислота, коллагеновые образования, некоторые липиды, ряд кристаллов и др.
Расщепленные в анизотропном объекте и проходящие через анализатор световые лучи характеризуются неодинаковой скоростью распространения волн. В зависимости от величины этой разницы (ее еще называют величиной задержки светового луча ) и от различий абсорбции света в анализаторе свечение анизотропных объектов может быть белым или цветным. В последнем случае речь идет о феномене дихроизма (двойная абсорбци я). Цветовые эффекты при исследовании в поле поляризации дают, например, многие кристаллы.
Процесс двоякого лучепреломления может быть усилен путем применения определенных красителей, молекулы которых обладают способностью ориентированно откладываться на анизотропных структурах. Гистохимические реакции, в результате которых возникает эффект анизотропии, называются топооптическими реакциями (G. Romhanyi). Различают две разновидности таких реакций — аддитивные и инверсивные. При аддитивных реакциях задержка светового луча увеличивается, что называют положительной анизотропией, при инверсивных реакциях она уменьшается — отрицательная анизотропия.
Поляризационную микроскопию проводят с помощью специальных поляризационных микроскопов. В качестве примера можно назвать импортные микроскопы , . Большинство современных оптических микроскопов оснащаются принадлежностями для поляризационной микроскопии.
Для поляризационной микроскопии можно приспособить любой световой микроскоп лабораторного и исследовательского класса. Достаточно иметь два поляризационных фильтра, один из которых, выполняющий функцию поляризатора, помещают между источником света и препаратом, а другой, играющий роль анализатора,— между препаратом и глазом исследователя. Поляризатор может быть встроен в конденсор или же размещен под ним над полевой диафрагмой, а анализатор — в слот револьвера или же промежуточную вставку.
На рис. 3 представлена принципиальная схема поляризационного микроскопа. Помимо общих для всех световых микроскопов компонентов, в поляризационном микроскопе имеется два поляризационных фильтра (поляризатор, размещаемый обычно под конденсором, и анализатор, находящийся в окуляре), а также компенсатор. Анализатор должен обязательно вращаться, причем для определения степени вращения необходима соответствующая градуированная шкала.
В поляризационном микроскопе используется источник освещения, обеспечивающий высокую плотность светового пучка. В качестве такого источника рекомендуют применять лампу мощностью 100 Вт при напряжении 12 В. Для некоторых видов исследования требуется монохроматический свет. С этой целью используют металлический интерференционный фильтр, который лучше поместить над зеркалом . Рассеивающее свет матовое стекло помещают перед поляризатором, т.е. между ним и источником освещения, но ни в коем случае не после поляризатора, так как при этом нарушается функция поляризационного фильтра.
Раньше для поляризационной микроскопии применялись ахроматические объективы без внутренних натяжений, однако сейчас они редкость. На сегодняшний день в поляризационном микроскопе используют только планахроматические объективы, которые не имеют внутренних натяжений. Апохроматические объективы можно применять лишь в тех случаях, когда требуется нормальная цветопередача при микрофотографировании .
Поляризационные микроскопы оснащаются вращающимся предметным столиком, положение которого относительно оптической оси можно менять. Угол поворота столика измеряют с помощью градусной шкалы, нанесенной по его окружности. Одним из обязательных условий, обеспечивающих эффективное применение поляризационной микроскопии, является тщательная центровка вращающегося предметного столика с помощью центровочных винтов.
Важным элементом поляризационного микроскопа является компенсатор, помещаемый между объективом и анализатором, обычно в тубусе микроскопа. Компенсатор представляет собой пластинку, изготавливаемую из особых сортов гипса, кварца или слюды. Он позволяет измерять разницу хода расщепленных световых лучей, выражающуюся в нанометрах. Функционирование компенсатора обеспечивается его способностью изменять разницу хода световых лучей, низводя ее до нуля либо увеличивая до максимума. Это достигается вращением компенсатора вокруг оптической оси.
Поляризационную микроскопию удобнее проводить в затемненном помещении, так как интенсивность светового потока, попадающего в глаз исследователя, уменьшается в 2 раза по сравнению с исходной. После включения осветителя микроскопа вначале добиваются максимально яркого освещения поля зрения путем вращения поляризатора или анализатора. Такое положение поляризационных фильтров соответствует совпадению их плоскостей поляризации. Препарат помещают на предметный столик и изучают его сначала в светлом поле. Затем путем вращения поляризатора (или анализатора) максимально затемняют поле зрения; эта позиция фильтра соответствует перпендикулярному расположению плоскостей поляризации. Для того чтобы выявить эффект анизотропии, нужно совместить плоскость поляризации анизотропного объекта с плоскостью поляризованного света. Эмпирически этого добиваются путем вращения предметного столика вокруг оптической оси. Если для поляризационной микроскопии используют световой микроскоп, не оборудованный вращающимся столиком, то приходится вращать гистологический препарат вручную. Это допустимо, однако в таком случае нельзя проводить отдельные виды поляризационной микроскопии, требующие количественной оценки (определение знака двоякого лучепреломления, величины разницы хода световых лучей).
Если анизотропные объекты в исследуемом препарате расположены упорядоченно (например, анизотропные диски поперечнополосатых мышечных волокон), их удобно изучать в фиксированном положении предметного столика, при котором эти объекты дают максимальное свечение на темном фоне. Если же анизотропные структуры располагаются в препарате хаотично (например, кристаллы), то при их исследовании приходится постоянно вращать предметный столик, добиваясь свечения той или иной группы объектов.
Для проведения более углубленного анализа и оценки топооптических реакций необходимо знать методику определения относительного знака двоякого лучепреломления, величины разницы хода лучей и индекса (коэффициента) лучепреломления.
Знак двоякого лучепреломления характеризует степень и направление смещения хода световых лучей, проходящих через анализатор. Это смещение вызывается топооптическими красителями, и в том случае, если оно направлено в сторону уменьшения разницы хода лучей, говорят об отрицательном знаке двоякого лучепреломления (отрицательная анизотропия ), если же оно способствует увеличению разницы хода лучей, то констатируют положительный знак двоякого лучепреломления (положительная анизотропия ). Если разница хода лучей исчезает, то эффект анизотропии нивелируется.
Знак двоякого лучепреломления определяют с помощью компенсатора. Процедура его применения заключается в следующем. Исследуемый объект помещают в положение, при котором в темном поле зрения достигается максимальное свечение анизотропных структур. Пластинку RI-компенсатора поворачивают вокруг оптической оси под углом +45° по отношению к плоскости поляризации анализатора. Объект в зависимости от разницы хода световых лучей, которая может колебаться от 20 до 200 нм, приобретает либо голубую, либо желтую окраску. В первом случае знак двоякого лучепреломления положительный, во втором — отрицательный. Следует иметь в виду, что в том случае, когда компенсатор расположен под углом +45°, общий фон затемненного поля зрения имеет красный оттенок.
Можно использовать также компенсатор λ/4 (U-TP137). Процедура его применения такая же, только поле зрения имеет не красный, а серый оттенок, и объект при положительном знаке лучепреломления светится, а при отрицательном — затемнен.
Количественное определение разницы хода световых лучей, выражаемой в нанометрах, осуществляют с помощью компенсатора Брака Келера. Для этого используют формулу:
Γ=Γλ×sinφ
где λ — константа, проставляемая на компенсаторе заводом-изготовителем, φ — угол поворота компенсатора относительно плоскости поляризации анализатора.
Индекс лучепреломления анизотропного объекта определяют путем его сопоставления (под микроскопом) с тест-объектом, помещаемым рядом. В качестве тест-объектов используют стандартные жидкости с известным индексом лучепреломления. Объект и образец помещают рядом на предметном столике. При несовпадении их коэффициентов преломления между объектом и образцом видна светлая линия, называемая линией Бека. Подъем тубуса микроскопа относительно сфокусированного положения вызывает смещение линии Бека в сторону среды, дающей более выраженный эффект лучепреломления. При совпадении коэффициентов лучепреломления объекта и образца линия Бека исчезает. Обычно коэффициент лучепреломления определяют в монохроматическом свете для натриевой линии спектра (при длине волны 589 нм и температуре 20 °С). Лучепреломление cледует определять для двух взаимно перпендикулярных плоскостей поляризации. С этой целью снимают анализатор и регистрируют лучепреломление объекта в его двух взаимно перпендикулярных положениях. Разница между обоими показателями лучепреломления (ng — nk) характеризует силу лучепреломления.
Фиксация материала для поляризационной микроскопии в кислом формалине нежелательна, так как формалиновый пигмент, образующийся при взаимодействии гемоглобина тканей с кислым формальдегидом, обладает анизотропными свойствами и затрудняет изучение препаратов в поляризованном свете. G. Scheuner и J. Hutschenreiter (1972) рекомендуют использовать с этой целью 10 % нейтральный формалин, раствор кальций-формола по Бейкеру, жидкость Карнуа.
Продолжительность фиксации в 10 % нейтральном формалине 24 — 72 ч при 4 °С, в растворе кальций-формола по Бейкеру — 16 — 24 ч при 4 °С. Фиксация в кальций-формоле особенно предпочтительна при исследовании липидно-белковых соединений. Жидкость Карнуа быстро пропитывает ткани. Кусочки толщиной 1 — 2 мм бывают профилированы уже через 1 ч при температуре 4 °С. Для исследования липидов фиксация в жидкости Карнуа непригодна. Кроме того, применяют жидкость Ценкера, особенно при импрегнации солями золота и серебра. После обработки смесью жидкости Ценкера и уксусной кислоты эритроциты приобретают способность к двоякому лучепреломлению.
При исследовании в поляризационном микроскопе плотных тканей (кости, зубы), помимо кислотной декальцинации, необходима дополнительная обработка для удаления коллагеновых волокон. С этой целью шлифы таких тканей в течение нескольких минут варят в смеси глицерина и гидроксида калия (10 мл глицерина и 2 крупинки гидроксида калия) до полного побеления, затем осторожно сливают щелочь, шлиф промывают в воде и переносят с помощью пинцета на предметный столик микроскопа.
Для поляризационной микроскопии используют парафиновые, замороженные и криостатные срезы. Неокрашенные замороженные срезы для изучения в поляризованном свете заключают в глицерин. Нефиксированные криостатные срезы пригодны для поляризационно-микроскопического анализа сразу после приготовления. В связи с их высокой чувствительностью к повреждающему действию различных факторов внешней среды эти срезы все же рекомендуют фиксировать в 10 % нейтральном формалине или растворе кальций-формола.
На результаты поляризационной микроскопии оказывает влияние толщина гистологических срезов. При исследовании толстых срезов создаются условия для наложения разных анизотропных структур друг на друга. Кроме того, при разной толщине срезов могут меняться анизотропные свойства изучаемых структур, поэтому очень важно, особенно при сравнительных исследованиях, обеспечивать постоянную толщину срезов. Рекомендуемая максимальная толщина срезов не должна превышать 10 мкм.
Еще одним обязательным условием является тщательное депарафинирование срезов, так как не удалённые остатки парафина дают выраженный эффект анизотропии, затрудняя исследование. Парафин особенно долго задерживается на эритроцитах и ядрах клеток. Для того чтобы полностью удалить парафин из срезов, рекомендуют провести их следующую обработку.
Следует также иметь в виду, что срезы, которые подвергают поляризационной микроскопии, не должны вступать в контакт с фенолами (например, их нельзя просветлять в карбол-ксилоле).
Более подробную информацию по поляризационной микроскопии и применении компенсаторов можно получить по ссылке (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Если у Вас возникли вопросы по поляризационной микроскопии, обратитесь в Школу микроскопии.
Предположим, у вас есть пара сломанных поляризационных стёкол (поляризаторов). Если вы возьмёте одно стекло и повернёте его по отношению к другому, вы получите темноту. Степень непрозрачности зависит от качества поляризаторов.
Подавление 95-98 % света - превосходный показатель; если он намного меньше, появляется грязно-серый оттенок, Взаимное положение поляризаторов при получении тёмного поля называется скрещенным, при получении наиболее светлого ноля - параллельным.
Перед тем как обратиться к поляризационной микроскопии, давайте вернёмся к упомянутому выше патологу.
Добавим в его светлопольный или фазовоконтрастный микроскоп между бинокулярной насадкой и корпусом микроскопа устройство, которое позволит вводить поляризационный элемент (анализатор) в оптический путь. Поместим другой поляризационный элемент (поляризатор) под конденсор и будем поворачивать его до получения полной темноты (анализатор и поляризатор скрещены); зафиксируем при этом их положение. Вставим в это устройство (между бинокулярной насадкой и корпусом микроскопа) выдвижной держатель с компенсатором - красной пластинкой первого порядка. Допустим, патолог исследует препарат ткани и замечает объект, похожий на кристалл. Он устанавливает анализатор, поляризатор поворачивает до скрещенного положения и рассматривает объект. Если это кристалл или кристаллическое образование, то оно светится, как если бы за полупрозрачным экраном был включён осветитель. Пока ещё патолог не может определить, кристалл ли это мочевой кислоты или кальция. Он вводит в ход лучей красную пластинку первого порядка и поворачивает её из одного установленного положения в другое: кристалл становится или красным, или зелёным. Таким образом можно определить природу кристалла. Затем патолог убирает из оптического пути анализатор и, при желании, поляризатор и продолжает работу (изучаемая область препарата остаётся в поле зрения).
Теперь обратим внимание на поляризационный микроскоп. Он включает многие компоненты, которые присутствуют в обычном светлопольном микроскопе, поскольку предполагает исследование препарата в светлом иоле между поляризующими элементами.
Довольно часто, особенно при обучении студентов, используют монокулярные поляризационные микроскопы по причине их низкой стоимости. Профессора предпочитают бинокулярные модели. В бинокулярной насадке может быть установлена либо фиксированная, либо с возможностью фокусировки линза Бертрана, необходимая для исследования
(её функции описаны ниже). Между насадкой и корпусом находится деталь, в которой располагается анализатор, и прорезь для установки компенсатора.
Микроскоп имеет круглый и вращаемый предметный столик, что позволяет рассматривать препарат, поворачивая его между скрещенными анализатором и поляризатором. Столик также оборудован шкалой для измерения его поворота в градусах и угловых минутах. Под предметным столиком (обычно под конденсором) находится поворачиваемый поляризатор с фиксацией его положения под 0, 45° и 90° к положению анализатора. Разумеется, в микроскоп установлена апертурная диафрагма и, как правило, держатель светофильтров.
В окуляре моно- или бинокулярной насадки есть перекрестие. Все центрирование проводится относительно этого перекрестия, препарат также поворачивается вокруг центра этого перекрестия.
Отличие механического предметного столика в том, что он должен быть низко расположен, чтобы при повороте об него не ударялись объективы. Очень часто это измерительный столик, который при перемещении в направлении восток - запад или север - юг последовательно фиксируется через заданные промежутки. Представьте себе шарик, который попадает в бороздку, - так работает механизм фиксации. Можно взять предмет острее шарика - эффект будет тот же. Когда вы поворачиваете объективы, механизм фиксации удерживает каждый объектив в оптическом ходе лучей.
Для подсчёта различных компонентов на тонком срезе им на счётчике присваивают номера от 1 до 9. Номер 10 предназначен для выбросов или суммирования. Исследователь перемещает препарат до фиксации столика и смотрит, находится ли один из 9 компонентов на перекрестии. Если там нет ни одного из них, то выбирают номер 10. При подсчёте материала на счётчике нужно указать число каждого из компонентов и всего остального на номере 10. После просмотра всего препарата можно рассчитать процентное содержание любого из 9 компонентов материала.
Компенсатор устанавливается в микроскопе под углом 45° к направлениям север - юг и восток - запад.
Большинство компонентов видны одинаково вне зависимости от того, как они расположены по отношению к компенсатору, но некоторые требуют поворота, и это ещё одна причина, по которой столик должен быть вращаемым. Мы не будем углубляться в описание функций различных компенсаторов или клиньев, так как вы можете приобрести специальную книгу по этому вопросу. Мы лишь упомянем некоторые названия: пластина в 1/4 длины волны - кварцевый клин, который может иметь 6, 30 или 120 порядков; красная пластинка первого порядка (у неё есть три других названия, позволяющие определить возраст тех, кто их использует: пластина замедления света, чувствительная тоновая пластинка и гипсовая пластина, самая старая).
Рассмотрим понятие «порядок». Когда свет преломляется через призму, становятся видны все цвета спектра, затем они становятся все бледнее (третий, четвёртый и т. д. наборы цветов-порядков). Нулевой порядок - это чёрный свет в самом начале спектра. Красная пластинка первого порядка, как и следует из названия, эквивалентна красному в первом порядке цветов.
Линза Бертрана в комбинации с окуляром даёт вспомогательную визирную трубку, позволяющую рассматривать интерференционные фигуры в выходном зрачке микрообъектива в то время, когда сам микроскоп сфокусирован на определённое зерно препарата. Если геологу необходимо идентифицировать материал, он поворачивает тонкий срез минерала между скрещенными поляризатором и анализатором. При этом видны 2 цвета (и только 2), а для превращения одного цвета в другой нужен специфический угол поворота препарата. Таким образом можно идентифицировать большинство минералов. Однако некоторые минералы так схожи по параметрам цвета и углам поворота, что интерференционная картина - единственный способ их идентифицировать.
Петрография изучает геологию нефти. У петрографического микроскопа нет линзы Бертрана, поскольку его пользователям интерференционная картина не нужна.
Стандартная геологическая работа выполняется на тонком шлифе. Он представляет собой тонкий срез камня, отшлифованный, заключенный в эпоксидной смоле на предметное стекло размером 1x2 дюйма и затем отшлифованный ещё раз для того, чтобы толщина шлифа не превышала 15 микронов; после этого препарат устанавливают на предметный столик и накрывают покровным стеклом. Такие препараты наблюдают в свете, идущем от поляризатора через тонкий шлиф.
Все подобные исследования относятся к светлопольному микроскопу, к которому добавляются поляризатор, анализатор и компенсатор.
Исследователь руды может начать подготовку образца так же, как и тонкого среза, сделав его толщиной в 6-10 мм и отшлифовав поверхность. Ему потребуется эпиосвещение, следовательно, между бинокулярной насадкой и корпусом микроскопа должен быть помещен осветитель. Там будет и лампочка, и трансформатор; поляризатор, анализатор, компенсатор; апертурная и полевая диафрагмы, дихроичное зеркало ит. д.
Работа объективов для поляризационного света отличается от работы стандартных объективов. Главное, они должны быть свободны от внутреннего натяжения. Натяжение в объективах возникает в результате давления металлических оправ на края линзы. При наблюдении через микроскоп это проявляется во вспышке белого света, идущего от точки давления по направлению к центру.
Производители тщательно проверяют объективы на наличие внутреннего натяжения. Те объективы, в которых нет натяжения, идут в комплект поляризационных микроскопов по высокой цене; а объективы с натяжением, идут в комплект биологических микроскопов, в которых натяжение не играет никакой роли, или вовсе бракуются.
Мы продемонстрировали вам необходимость наших объективов. Эти объективы предназначены и скоррегированы для работы с препаратами под покровными стёклами толщиной 0,17 мм.
При исследовании руды под микроскопом полированную поверхность не закрывают покровным стеклом. Для такой работы есть нам нужны объективы, которые не будут скорректированы относительно покровных стёкол, или объективы для металлографии, но без натяжения.
Объективы 10х могут работать как с покровными стёклами, так и без них. Для рудных микроскопов потребуются 20х и более сильные объективы, которые скоррегированы на отсутствие покровного стекла.
Наш стандартный поляризационный микроскоп обычно имеет в комплекте объективы 5х, 10х и 40х. Револьвер имеет 4 гнезда для объективов, поэтому мы добавили второй объектив 40х для препаратов без покровного стекла, получив таким образом, двойной световой поляризационный микроскоп. Ранее при описании окуляров Гюйгенса, в примечании, было сказано, что они не обеспечивают цветокоррекцию или компенсацию хроматической аберрации и для решения этой проблемы следует обратиться к разделу «Поляризационная микроскопия».
С того момента, как мы определились со значением цветов, мы не хотим, чтобы окуляр или объектив давали в поле зрения цвета, не принадлежащие препарату. Мы знаем, что объективы без натяжения были выбраны для поляризационных микроскопов, из-за отсутствия натяжения и цветовой коррекции. Следовательно, очень важно, чтобы и окуляры были без цветовой коррекции или компенсации. По этой причине поляризационные окуляры обычно модифицированы до окуляров Гюйгенса. Иногда применяются также широкопольные окуляры, но специально проверенные на соответствие поляризационному микроскопу.
Будьте внимательны при подсчёте общего увеличения поляризационного микроскопа. Из-за высоты устройства, служащего для крепления анализатора и компенсатора, появляется дополнительное увеличение бинокулярной насадки. Например, микроскоп, снабжённый револьвером на 3 объектива, имеет дополнительное увеличение 1,4х, а микроскоп с револьвером на 4 объектива - 1,8х.
На рис. 10 приведен общий вид поляризационного микроскопа.
1. 10-кратный широкопольный окуляр с большим выносом зрачка
2. Линза Бертрана
3. Прорезь для компенсатора
4. Микрообъективы без натяжения
5. Вращаемый предметный столик со шкалой на лимбе; цена деления 1°
6. Конденсор
7. Вращаемый поляризатор с возможностью вывода из хода лучей
8. Полевая ирисовая диафрагма
9. Фокусировочный 10-кратный окуляр с направляющей и перекрестием
10. Бинокулярная насадка с возможностью поворота на 360° и с углом наклона 30° к оптической оси
11. Винт крепления бинокулярной насадки
12. Держатель анализатора
13. Револьвер с микрообъективами
14. Штатив микроскопа
15. Клипсы препаратодержателя
16. Регулятор перемещения по высоте кронштейна конденсора
17. Коаксиально расположенные механизмы грубой и точной фокусировки
18. Основание микроскопа со встроенным трансформатором и регулировкой яркости галогеновой лампы 6 В, 30 Вт.
Из всего многообразия устройств для микроскопии, поляризационные микроскопы являются самыми сложными в техническом плане. Такое внимание к конструкции прибора по части технологичности обусловлено необходимостью получать изображение высочайшего качества, на которое непосредственно влияют конструкция оптической и осветительной частей микроскопа. Основная область использования поляризационных устройств для микроскопии - это изучение минералов, кристаллов, шлаков, анизотропных объектов, текстильной и огнеупорной продукции, а также других материалов, для которых свойственно двойное лучепреломление. На последнем принципе и построено формирование изображения в таких устройствах для микроскопии, в которых исследуемый образец облучается поляризационными лучами. При этом, анизотропные свойства образцов проявляются после изменения направления луча. Для этих целей, в конструкции поляризационных микроскопов предусмотрены вращающиеся в различных плоскостях относительно друг друга поляфильтры: анализатор поворачивается на 180 градусов, а поляризатор - на 360. Основной особенностью устройств для микроскопии в поляризационном свете является возможность проводить ортоскопические и коноскопические исследования, недоступные при использовании большинства других типов микроскопов.
Исследование образца под поляризационным микроскопом начинается с установки поляризатора в осветительной части микроскопа под конденсор, рядом с апертурной диафрагмой. При этом, анализатор находится между окуляром и объективом - за последним по ходу лучей света. При правильной настройке такого прибора для микроскопии, после скрещивания поляфильтров, видимое поле будет равномерно темным, образуя, так называемый, эффект погашения. По завершении настроек устройства, исследуемый образец закрепляется на предметном столике и проводится его изучение. Столики поляризационных микроскопов центрируются относительно оптической оси и могут поворачиваются на 360 градусов, а в подобных устройствах для лабораторных и исследовательских целей, так же имеют нониус. Оптика и осветительная система поляризационных микроскопов высочайшего качества и такой точности изготовления, что позволяет получать максимально четкое изображение без искажений. Часто в комплект устройств для проведения исследований образцов в поляризационном свете входят компенсатор и линза Бертрана. Первая дает возможность эффективно исследовать структуру минералов, а линза - увеличивать и сосредотачивать область наблюдения при появлении изменений изображения после поворота предметного столика. Сегодня на рынке представлены три основных типа таких устройств для микроскопии - это уже упомянутые исследовательские и лабораторные, а также рабочий поляризационный микроскоп.
