Western blotting uses to identify proteins that have been separated based on size by gel electrophoresis. The immunoassay uses a membrane made of nitrocellulose or PVDF (polyvinylidene fluoride). The gel is placed next to the membrane and application of an electrical current induces the proteins to migrate from the gel to the membrane. The membrane can then be further processed with antibodies specific for the target of interest, and visualized using secondary antibodies and detection reagents.
View our Western blot protocol video below.
These buffers may be stored at 4°C for several weeks or aliquoted and stored at -20°C for up to a year.
NP-40 buffer
RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer)
Tris-HCl
Check the pH and adjust to 6.8
Running buffer (Tris-Glycine/SDS)
Transfer buffer (wet)
For proteins larger than 80 kDa, we recommend that SDS is included at a final concentration of 0.1%.
Transfer buffer (semi-dry)
Blocking buffer
3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)
Add to TBST buffer. Mix well and filter. Failure to filter can lead to spotting, where tiny dark grains will contaminate the blot during color development.
Preparation of lysate from cell culture
Preparation of lysate from tissues
We recommend reducing and denaturing the samples using the following method unless the online antibody datasheet indicates that non-reducing and non-denaturing conditions should be used.
The time and voltage may require optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. A reducing gel should be used unless non-reducing conditions are recommended on the antibody datasheet.
The gel percentage required is dependent on the size of your protein of interest:
Protein size | Gel percentage |
Gradient gels can also be used.
The membrane can be either nitrocellulose or PVDF. Activate PVDF with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer before preparing the stack. The time and voltage of transfer may require some optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. Transfer of proteins to the membrane can be checked using Ponceau S staining before the blocking step.
Prepare the stack as follows:
Figure 1. Example of prepared stack.
All lanes: beta Actin antibody - loading control (ab8227) at 1/5000 dilution
Lane 1: HeLa whole cell extract
Lane 2: Yeast cell extract
Lane 3: Mouse brain tissue lysate
Protocols are provided by Abcam “AS-IS” based on experimentation in Abcam’s labs using Abcam’s reagents and products; your results from using protocols outside of these conditions may vary.
Webinar transcript
The purpose of western blotting is to separate proteins on a gel according to the molecular weight. The proteins are then transferred onto a membrane where they can be detected using antibodies. Heat the samples and 95 degrees C for five to 10 minutes in a sample buffer containing a reducing agent such as beta mercaptoethanol. This results in linearized proteins with a negative charge proportional to their size.
Place a gel into the electrophoresis tank and ad in buffer, ensuring the tops of the wells are covered. Acrylamide percentage of the gel being used depends on the molecular weight of the target protein. Node a molecular weight market into the first lane then load the samples into adjacent wells. All the samples which contained equal amounts of protein. Once all the samples are loaded, ad running buffer, place the lid onto the electrophoresis tank. Turn on the power supply and set the voltage recommended by the manufacturer of the gels in the gel tank. You should be able to see bubbles rising through the tank. Run the gel until the die front has moved sufficiently down the gel.
The next stage is to transfer the proteins from the gel onto a membrane. Membranes are usually made from nitrocellulose or PVDF. Remove the gel from the tank and carefully release it from its plastic case. Cut up the wells and the gel foot and place the gel into transfer buffer. Prepare the transfer stack by sandwiching the membrane and gel between filter paper and sponges. The membrane should be traced to the positive electrode and the gel closest to the negative electrode. Use a small roller to remove any bubbles between the gel and the membrane. Cap the transfer case closed and submerge into a transfer tank containing transfer buffer. Add water to the outer chamber to keep the system cool and put on the lid. Turn on the power supply to begin protein transfer. Time and voltage require optimization, so check the manufacturer"s instructions for guidance.
Now that the proteins have migrated from the gel onto the nitro cellulose membrane, the protein of interest can be detected as an antibody. The membrane can be removed from the cassette and the molecular weight market should now be visible. If required, the transfer of proteins can be confirmed by staining the membrane with solution. To prevent nonspecific binding of the antibody, the membrane needs to be blocked. Pour blocking buffer onto the membrane and agitate gently on a rocker. Typically, this is done using a solution of five percent milk or bovine serum albumin, BSA, for two hours at room temperature or overnight at four degrees. The time and type of blocking buffer should be optimized, so check the data sheet of the primary antibody you intend to use for details.
After the membrane is blocked, remove the blocking buffer and add the diluted primary antibody in the same solution. Incubate on the rocker as before. Typically primary antibody incubations are for one hour at room temperature or overnight at four degrees C. Antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Refer to the antibody datasheet for guidance. Pour off the primary antibody and rinse the membrane twice in wash buffer. Follow with one 15 minute wash and three 10 minute washes on a rocker. The wash buffer is usually Trys buffered saline, TBS, or phosphate buffered, saline, PBS, with 0.1 percent tween 20.
Pour off the wash buffer and incubate the membrane in conjugating secondary antibody which has been diluted in blocking buffer. Usually this is done for one hour at room temperature, but antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Pull off the secondary antibody and wash the membrane has shown previously.
There are several different systems for detection. If the secondary antibodies conjugate into an enzyme, incubate the membrane in the appropriate substrate before imaging. If the secondary antibodies are fluorescent counjugates then you can move directly onto the imaging step. Imaging can be carried out with x Ray film or with a digital imaging system. Place the membrane into an imaging tray. Place the imaging tray into imaging system. Exposure times will most likely need to be optimized in order to clearly detect the bands relating to the proteins of interest.
Вестерн-блоттинг — метод, который заключается в поиске специфических антител против бактерий, вызывающих болезнь Лайма. Что такое тест Вестерн-блот? Как интерпретировать результаты исследования?
Вестерн-блоттинг — это тест, который ищет антитела, которые организм вырабатывает против бактерий, вызывающих болезнь Лайма. На поверхности бактерий существуют антигены, против которых организм имеет специфические антитела в классе IgM и IgG. IgM.
Иммуноглобулины M (IgM) — производятся, когда наш организм впервые встречает данный патоген. Увеличение количества IgM против данного патогена указывает на начало процесса заболевания.
Иммуноглобулины G (IgG) продуцируются организмом после IgM, самый высокий уровень достигается около полугода после заражения, и в отличие от IgM антитела могут сохраняться в крови в течение очень долгого времени, даже нескольких лет.
Вестерн-блот используется во втором этапе диагностики боррелиоза — когда тест ELISA (первый тест) дал положительный или сомнительный результат. Однако он не используется, когда тест ELISA дал однозначно отрицательный результат.
Тест Вестерн-Блот на боррелиоз (болезнь Лайма) точно оценивает антитела к различным фрагментам бактерий. Различные антитела
против отдельных бактериальных фрагментов графически отражены как черные полосы на нитроцеллюлозной бумаге.
1. Для проведения теста необходимы два основных элемента: сыворотка крови пациента и убитые и фрагментированные культивируемые бактерии боррелиоза.
Не делайте этот теста вскоре после укуса клеща. Подождите минимум 4 недели. Стоимость исследования методом Вестерн-Блоттинг в обоих классах антител составляет около 2500-5000 рублей.
2. Под воздействием электрического тока происходит распределение на факторы, в первую очередь бактерий, полученной из культуры клеток, в том числе на бактериальные белки (антигены). Затем эти белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрана разрезается на полоски.
3. Полоска с антигенами, в сочетании с сывороткой крови пациента, окрашивается с использованием специальной методики, которая обнаруживает антитела, специфически связанные с антигенами Sprechete Borrelia.
4. В местах, где антитела пациента связаны с белками (антигенами) бактерий боррелиоза, мы замечаем характерные полосы (что указывает на инфекцию бактериями Лайма). Результат теста положительный.
Каждая полоса соответствует бактериальному белку (антиген). Если белки клеток Боррелиоза и антитела не соединяются, полоса не появится. Тогда результат отрицательный.
Тест Вестерн-Блот — когда надо делать?
Ранняя диагностика болезни Лайма проблематична из-за так называемого серологического окна. Это период от начала инфицирования до старта продуцирующего детектируемых антител организмом. В случае болезни Лайма серологическое окно длится в среднем 4 недели.
Выполнение тестов менее чем за 4 недели после укуса клещей создает риск получения ложноотрицательного результата.
Тест Вестерн-Блот — положительный результат
Наличие антител против Боррелий означает, что у вас болезнь Лайма. Однако трудно ответить на вопрос, активна ли инфекция или нет.
IgG-антитела, полученные в результате инфекции, можно обнаружить в крови даже через 10, а иногда через 20 лет после диагноза болезни Лайма.
Также случается, что обнаруженные антитела класса IgM (обычно считающиеся активным маркером инфекции) могут быть постоянными и также не указывают на активную инфекцию.
Тест может дать отрицательный результат в начальный период заболевания, т.е. В первые несколько недель после укуса.
Тест Вестерн-блот может дать ложно отрицательный результат и в другой ситуации — когда в старом хроническом боррелиозе производство антител было остановлено или когда антитела были полностью использованы в борьбе с этим заболеванием.
Если подозрение на болезнь Лайма сильное, исследование Вестерн-Блот стоит несколько раз повторять, например, каждые несколько недель, чтобы попасть на такой момент, когда антитела присутствуют в крови.
Наличие антител в активной болезни Лайма варьируется, и у человека с отрицательным результатом есть шанс получить положительный результат при повтороном тесте через несколько недель. Иногда подтверждение диагноза получают только после четвертого или пятого раза.
В этом случае некоторые врачи пытаются получить подтверждение инфекции по-другому: они лечат пациента антибиотиками в течение нескольких недель и через 5-6 недель они направляют его на Вестерн-блоттинг.
Лечение антибиотиками в течение такого времени не может излечить хроническое заболевание, но оно настолько изменяет иммунную систему, что в крови будет достаточно антител, чтобы их можно было обнаружить. Результат Вестерн-блот теста должен интерпретироваться врачом, который специализируется на лечении болезни Лайма
Тест ВБ может проводиться и во время антибактериальной терапии, но с антибиотиками вероятность положительного результата несколько меньше. Самый простой способ диагностировать болезнь с этим тестом — через 6 недель после прекращения терапии антибиотиками.
Важно
Интерпретация исследования — это интерпретация полос. Как правило, следует полагать, что чем больше полос, тем надежнее диагноз. Три полоски это уже действительно большая уверенность, а 5-6 полос — болезнь Лайма с практически 100% вероятностью.
Полосы IgM имеют большее диагностическое значение, поскольку они предполагают активную фазу клещевого боррелиоза, хотя обнаруженные антитела в IgM-классе (полосы IgM) могут быть постоянными и не указывать на активную инфекцию. Оказывается потому, что IgM высок в начале инфекции и, вопреки логике, при хронической болезни Лайма.
Повышенные уровни антител в классе IgG можно рассматривать как остаточную инфекцию, или это означает хроническое активное заболевание.
Даже отрицательный результат теста не означает, что болезнь Лайма отсутствует. Отрицательный результат теста означает только, что в крови нет антител против бактерий боррелиоза — это может иметь место, например, когда бактерии вошли в организм, а производство антител еще не началось (врачи называют этот период серологическим окном).
Из-за множества методов проведения этого исследования трудно сделать универсальные рекомендации относительно интерпретации. Каждая лаборатория использует свои критерии.
Болезнь может быть обнаружена только врачом-специалистом на основании симптомов и результатов лабораторных испытаний. Тест Вестер-Блот нельзя интерпретировать без учёта симптомов.
После того как ДНК, РНК или белки разделены, они должны быть перенесены на твердую подложку для детекции и других операций, которые в геле идут с трудом. Процесс переноса, приводящий к иммобилизации молекул , т.е. закреплению в неподвижном состоянии, называется блоттингом (по англ. – blotting ). В качестве подложки используются нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны.
Блоттинг (от англ. blotting – промокание) – это метод перенесения электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы, связывающую (иммобилизующую) одноцепочечные молекулы ДНК.
Саузерн-блоттинг (по фамилии предложившего его автора) основан на перемещении фрагментов ДНК благодаря капиллярному эффекту. Процесс переноса фрагментов ДНК, находящихся в агарозном геле, на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги похож на промокание.
Анализ проводят следующим образом:
– Выделенную, очищенную, денатурированную и разбитую на фрагменты ДНК помещают на лист агарозного геля, где происходит электрофоретическое разделение фрагментов по массе и заряду.
– Лист агарозного геля помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным солевым (буферным) раствором.
– Затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, где происходит иммобилизация (или адсорбция, или фиксация) одноцепочечных фрагментов ДНК.
– Поверх фильтра накладывают стопку листов сухой фильтровальной бумаги, которая обеспечивает медленный ток буферного раствора через гель (т.е. служит своеобразным капиллярным насосом). Солевой раствор, проходя через агарозный гель, увлекает за собой фрагменты ДНК, которые задерживаются нитроцеллюлозой и связываются с ней, а раствор впитывается сухой фильтровальной бумагой.
– Далее ДНК денатурируют щелочью, а фильтр выдерживают в вакууме при температуре 80 0 С, в результате чего одноцепочечные фрагменты ДНК необратимо иммобилизуются (фиксируются) на нитроцеллюлозе. При этом расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.
– ДНК, связанную с фильтром, помещают в раствор с меченым ДНК зондом, в котором и происходит гибридизация. Гибридизироваться (образовывать водородные связи) со специфическим зондом будут только комплементарные ему фрагменты ДНК, которые можно обнаружить в виде светлых полос на рентгеновской пленке, т.е. радиоавтографии нитроцеллюлозного фильтра
Дот-блоттинг . Для приготовления дот-блоттов препарат ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр. Капельки препарата выглядят в виде точек на фильтре, что объясняет название типа блоттинга (англ. dot –точка). 1) Из геномной ДНК, предварительно обработанной ультразвуком, образуются фрагменты длиной 5–10 пар нуклеотидов.
2) Чтобы сделать ДНК- или РНК-пробы доступными зонду, их нужно денатурировать, т.е. перевести в одноцепочечную форму. Это происходит под воздействием температуры 100 °С.
3) Денатурированные нуклеиновые кислоты инкубируют на льду: быстрое понижение температуры предотвращает их ренатурацию, т.е. комплементарное спаривание цепей. Денатурированную ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр, который инкубируют в растворе, содержащем зонд.
4) Чтобы анализируемая нуклеиновая кислота не перешла в раствор, ее необходимо зафиксировать на фильтре (мембране). Для этого используют два типа фильтров: нитроцеллюлозный и нейлоновый.
Для иммобилизации нуклеиновых кислот на нитроцеллюлозном фильтре используют прожаривание при 80 °С в вакууме, а на нейлоновом фильтре – УФ-облучение в течение 3–5 минут.
5) После инкубации препарата нуклеиновых кислот с меченым изотопом зондом проводят радиоавтографию в специальной кассете или идентификацию нерадиоактивными методами.
Дот-блоттинг позволяет ответить только на один вопрос: есть ли в данном образце искомая последовательность нуклеотидов.
Нозерн-блотт анализ применяется:
1) для выделения и анализа РНК (например, для выяснения того, присутствует ли в данном типе клеток мРНК, считанные с данного гена, т.е. экспрессируется ген или нет;
2) для определения количества этой РНК и его изменения в развитии данного типа клеток;
3) для определения размера транскрипта какого-то гена.
В данном случае молекулы РНК, выделенные из клетки, разделяются по размерам с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются места гибридизации (гомологии) РНК и зонда.
Если нуклеотидная последовательность искомого гена (или мРНК) не известна, но известен белок, синтез которого он контролирует, то можно выделить небольшое количество чистого белка, определить аминокислотную последовательность некоторой его части (достаточно знание 5–6 аминокислотных остатков). Пользуясь таблицей генетического кода, можно установить все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК (или самого гена), который кодирует данную аминокислотную последовательность. В этом случае можно синтезировать зонд для поиска нужных клонов в библиотеке генов.
Вестерн-блоттин г (иммуноэлектроблоттинг, белковый блоттинг) –это метод идентификации уникальных белков. В его основе лежит явление высокоспецифичного взаимодействия антиген–антитело. Таким образом, антигеном (мишенью) является определяемый белок, а зондом – антитело к нему.
Антитела к исследуемому белку получают различными способами. Наиболее простым является введение очищенной пробы белка в кровяное русло лабораторного животного (обычно кролика). В его организме вырабатываются антитела (иммуноглобулины) к данному чужеродному белку. Это первичные антитела, которые и будут взаимодействовать с белком-мишенью.
Однако было бы не рационально вводить метку для идентификации непосредственно в данные антитела. Для определения разных белков потребовалось бы метить разные антитела, что привело бы к их высокой стоимости. Более разумным оказалось использование универсальных антител – конъюгированных антииммуноглобулинов , являющихся, по сути, антителами к антителам, выработанным при использовании идентифицируемого белка как антигена. К примеру, конъюгированные антииммуноглобулины к Ig кролика будут взаимодействовать со всеми иммуноглобулинами, синтезированными у кролика к разным антигенам. Таким образом, именно такие универсальные вторичные антитела несут изотопную или нерадиоактивную метку. Кроме неизотопной метки, которая в ходе ряда реакций приводит к образованию нерастворимого окрашенного соединения (как в случае блоттинга нуклеиновых кислот), очень часто используют хемилюминесцентную метку, обладающую более высокой чувствительностью.
1) Экстракция белков из гомогената
2) Разделение белков по молекулярным массам с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Метод SDS-электрофореза подразумевает денатурацию нативных белков. Таким образом, молекулы белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, пройдут в геле одинаковый путь и выстроятся в виде полосы. Поскольку в смеси присутствуют белковые молекулы разного размера, образуется множество полос. Визуализировать результаты электрофореза можно окрашиванием белка (кумасси бриллиантовый синий, амидо черный, окрашивание серебром). Окрашивание серебром обладает уникальной чувствительностью, что позволяет определить всего 0,1 нг белка в полученной полосе. Это очень важно для контроля количества белка, нанесенного на гель.
3) Перенос белков из геля на мембрану. Это делается потому, что полиакриламид не позволяет диффундировать большим молекулам иммуноглобулинов к белку. А иммобилизованный на мембране белок становится доступным антителам. В отличие от блоттинга нуклеиновых кислот перенос белка на мембрану происходит под воздействием электрических сил, т.е. в электрическом поле.
4) Полученный блот инкубируют с антисывороткой к белку, а затем с антииммуноглобулинами. Результат визуализируют в соответствии с используемым типом метки.
Ограничения:
1) большой размер исследуемых фрагментов, значительно превосходящий длину ДНК-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу;
2) невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяющихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК;
3) необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию, что равноценно 0,5-1 мл крови),
4) для геномной гибридизации - наличие радиоактивных ДНК-зондов с высокой удельной активностью не менее 109 имп./мин*мкг), действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока. К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов.
5) большая трудоемкость исследований
В практике лабораторной диагностики инфекционных заболеваний существует иногда необходимость определять антитела не вообще к патогену, а к определенным его белкам (антигенам), то есть спектр специфических антител. Если с этой целью использовать метод твердофазного иммуноферментного анализа, то в таком случае приходится предварительно из культуры патогена выделять и очищать необходимые антигены. Полученные белки наносят отдельно на твердую фазу. В случае использования 96-лу-ночного планшета - в каждую лунку по одному виду антигена. Затем определяют специфические антитела непрямым методом.
По наличию положительной реакции в лунке с тем или иным антигеном, можно судить о наличии соответствующих специфических антител. Такого рода иммуноферментные тест-системы предлагаются фирмами-производителями, однако широкое распространение, благодаря большей информативности и простоте исполнения самого исследования, получил метод иммунного блотинга (Western blot).
Иммунный блотинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагностически значимым белкам патогена. Перевод с английского Western blot означает западный перенос (дословно - промакивание). История этого необычного термина следующая.
Ученый по фамилии Саузерн (Е. Southern) в 1975 году впервые предложил метод переноса электрофорети чески разделенных фрагментов ДНК из геля на мембрану. По автору метод и был назван Southern blot, что в переводе означает «южный перенос». Метод переноса молекул РНК в свою очередь был специалистами прозван Northern blot - «северный перенос». Поначалу в шутку, а затем это название закрепилось и в официальной научной литературе.
Г. Тоубин в 1979 году опубликовал результаты первых опытов по белковому блотингу. В продолжение традиций «географических» наименований методов переноса биологических макромолекул данный метод стал именоваться «западным» переносом -Western blot.
На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, являясь поверхностно активным веществом, равномерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от размеров молекулы (молекулярной массы) белка.
В результате электрофоретической процедуры получают гелевую пластину, в толщине которой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движения они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой молекулярной массы, порядка 120-150 кДа, а к финишу далее всех продвинулись протеины массой 5-10 кДа. На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и помешают эту конструкцию между электродами источника постоянного тока. Под действием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются.
Полученный блот обрабатывается блокирующим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), которые блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист-мембрану разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержала все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем.
В коммерческих тест-системах для определения антител методом иммунного блотинга содержатся уже готовые к исследованию блоты (полоски, или стрипы). Пользователь проводит определение всего спектра специфических антител к белкам патогена по схеме непрямого метода. В качестве хромогена для проведения цветной (ферментативной) реакции используют растворимое бесцветное вещество, продукт которого приобретает окраску, становится нерастворимым и оседает (преципитирует) на нитроцеллюлозе.
В результате последовательного проведения иммунных и ферментативной реакции при наличии в исследуемой пробе антител к белкам патогена на блоте появляются темные поперечные полоски, расположение которых находится в зоне определенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена. Например: «выявлены антитела к белкам р17 и р24».
Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Однако интенсивность окраски при этом значительно ослабевает. Влажные блоты можно фотографировать или с помощью сканеров вводить их графическое изображение в память персональных компьютеров. Специальные компьютерные программы позволяют обрабатывать полученные результаты и оперативно отслеживать динамику спектра антител при динамическом наблюдении